细胞的冻存与复苏

一、   程序冻存步骤（需梯度降温）

1、 配置冻存液，冻存液推荐配比：55%（基础培养基）+40%(血清)+5%（DMSO）或90%胎牛血清+10%DMSO；推荐使用Procell通用血清型程序冻存液，货号PB180436；

2、 制备好的细胞悬液计数，计算总细胞量；

3、 细胞离心后尽量吸干净上清，离心转速1200rpm（250g）3min；

4、 加入配置好的冻存液重悬，调整细胞浓度为3×10⁶~1×10⁷cells/mL；

5、 分装入冻存管，一个冻存管分装1~1.5毫升；

6、 推荐使用程序降温盒，分装好的冻存管转入程序降温盒后直接放入-80℃冰箱过夜；

7、 如没有程序降温盒，则按下列顺序依次降温：室温→4℃ 20min→-20℃ 30min→-80℃过夜→液氮保存，注意转移过程中要保冷，避免产生温差或冻存管融化；

8、 从-80℃冰箱取出冻存管迅速转移到液氮长期保存。

注意事项：

1、 DMSO配制的时候会放热，一定要等冻存液冷却后使用，避免灼伤细胞；

2、 细胞离心后尽量吸干净上清液，减少培养基残留，避免稀释冻存液；

3、 不建议手动梯度降温，温度不稳定，容易降低存活率；

4、 注意程序降温盒内异丙醇的量必须高于最-低刻度线；冻存5次后异丙醇需要更换一次，以免影响冻存效果；程序降温盒需恢复到室温以后才能继续使用，不能从冰箱拿出来直接使用；

5、 细胞悬液加入冻存液以后尽量短时间的在常温放置，DMSO常温下对细胞损伤大，分装完成后立即转入程序降温盒放到-80度冰箱，不需要放4度；

6、 -80度冻存过夜后可以转入液氮长期保存，转入液氮的过程需要对冻存盒进行保冷，不要长时间在常温暴露，避免冻存管融化；

7、 若没有液氮罐，存放在-80度的时候一定要放靠里面的位置，避免开关冰箱导致温度不稳定。

8、 细胞冻存后应取出一管复苏，检测细胞的存活率。理论上细胞可在液氮内长期保存，为稳妥起见可在细胞冻存半年后复苏培养，观察细胞生长情况，再继续冻存；

二、   非程序冻存步骤（需使用无血清冻存液）

1、  冻存液丛冰箱提前拿出回温到室温，推荐Procell无血清非程序冻存液，货号PB180438；

2、  制备好的细胞悬液计数，计算总细胞量；

3、  细胞离心后尽量吸干净上清，离心转速1200rpm（250g）3min；

4、  加入无血清非程序冻存液（PB180438）重悬，调整细胞浓度为3×10⁶~1×10⁷cells/mL；

5、  分装入冻存管，一个冻存管分装1~1.5毫升；

6、  分装好的冻存管直接转入-80度冰箱过夜，不需要程序降温盒；

7、  转入液氮途中需将冻存管做好保冷措施，避免直接暴露于常温，快速转入液氮罐进行长期保存；

注意事项：

1、 由于没有使用冻存盒，在转入液氮的过程中一定要对冻存管做好保冷措施，不能直接用手拿，可以用干冰或者少量液氮保护后转移，操作过程注意安全；

2、 转移过程要快，避免冻存管暴露于常温后融化；

3、 若没有液氮罐，存放在-80度冰箱的时候一定要放靠里面的位置，避免开关冰箱导致温度不稳定；

三、   细胞复苏步骤

1、  将水浴锅预热至37℃，准备好干净的一次性PE手套，一个无菌离心管内加入9ml无菌培养基；

2、  将细胞从液氮罐中取出放入PE手套中，迅速没入水浴锅，摇晃冻存管加速溶解，以1分钟内全部溶解为宜；

3、  在超净台中将复苏好的细胞液加入到装有新鲜培养基的离心管内，1200rpm/min 离心3分钟，离心完毕去掉上清；

4、  用适量与细胞对映的*培养基重悬细胞，接入到无菌容器中（培养瓶或培养皿），补充培养基到适宜，放入培养箱培养；

注意事项：

1、 水浴锅的位置如果与液氮罐不是一个房间，需要对冻存管进行保冷后转移到水浴锅旁，避免路途细胞表面融化；

2、 细胞溶解过程快速摇晃以加速溶解；

3、 已溶解的冻存细胞尽量短时间的在常温存放，尽快离心去除DMSO；

4、 贴壁细胞复苏24小时后观察，若密度达到80%，则正常传代；若密度不到80%则继续培养到48小时再换液；

5、 悬浮细胞复苏3天内不建议离心换液；

6、 对DMSO不敏感的细胞在复苏时也可不离心，减少操作步骤，也可降低污染的几率。将解冻的细胞悬液直接转移至T25细胞瓶内，补加新鲜培养基，放入温箱内培养。但培养12~24h后必须换新鲜的培养基，移除死细胞。