细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤

细胞冻存与细胞复苏，是细胞培养过程中的常见工作。

细胞冻存，是指将细胞贮存在超低温环境中，使细胞暂时“冬眠"的技术，在需要的时候再进行复苏。

细胞复苏，是把冻存在-80℃冰箱或液氮中的细胞快速解冻，并使细胞重新恢复生长的技术。

本文将为大家介绍细胞冻存与复苏的技术要点和操作步骤。 

细胞冻存原则为“慢冻"，即让细胞在缓慢降温的条件下逐渐冷冻。

如果直接将细胞悬液放在超低温下快速冷冻，细胞会受到冷冻损伤而死亡。在冻存液中添加的保护剂（如DMSO、甘油）和在冻存盒中添加的异丙醇，都起到程序性降温的作用。

DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中，延缓温度下降速度，减少细胞内冰晶的形成，从而起到保护细胞的作用。

需注意的是，DMSO溶于培养基时，将释放大量热量，所以细胞冻存液需提前配制，不能直接将DMSO加入含有细胞的培养基中，避免烫伤细胞。

另外，DMSO属于致癌物质，使用时应戴好手套，规范操作。

程序冻存液成分一般由基础培养基、胎牛血清、DMSO组成。血清比例为10%~90%，DMSO比例为5%~10%。根据普诺赛实验室细胞培养经验，推荐冻存液配比：55%基础培养基＋40%胎牛血清＋5%DMSO，难养细胞可用90%胎牛血清＋10%DMSO冻存。

细胞冻存和复苏过程中，不可避免会损失部分细胞，所以冻存的密度不能太低。提高冻存密度有助于提升细胞复苏存活率，推荐密度为100~300万细胞/mL。

使用程序降温盒是最-常用的冻存方法。市面上的降温盒有些需要添加异丙醇，有些则不需要。

降温盒须恢复室温后再使用。

根据普诺赛实验室细胞培养经验，使用程序冻存盒冻存效果良好，没有冻存盒的同学可以参照下文方法二和方法三。

无血清非程序冻存液是一种商品化的冻存液，无需自己配制，无需降温盒，大大提升了便捷性。

但是，并非所有细胞都适用于这种冻存液，使用前必须做冻存测试，没问题后再批量应用。

▲ 使用无血清非程序冻存液操作示意图

在没有冻存盒或者非程序冻存液时，可以选择手动梯度降温。但手动梯度降温不适用于所有细胞，且效果不稳定，同样需要先做冻存测试。

▲ 手动梯度降温操作示意图

细胞复苏讲究“快融"，越快融化，细胞所受损伤就越小。细胞复苏的操作不复杂，但每一步都必须稳扎稳打，才能最大限度地提高复苏存活率。

步骤1：水浴锅预热至37℃备用

步骤2：准备15mL离心管，并向其中加入适量培养基待用

步骤3：将细胞冻存管从-80℃冰箱或液氮中取出，放入PE手套中，迅速投入水浴锅

步骤4：用力摇晃冻存管，使其在1分钟内融化

步骤5：用纸巾擦拭水渍，转移至生物安全柜。用移液枪吸取细胞悬液，缓慢滴加到步骤2中准备好的离心管

步骤6：1200rpm离心3分钟

步骤7：弃上清，用新鲜培养基重悬细胞，接种至新的无菌培养器皿中

▲ 细胞复苏操作示意图

做完步骤7，细胞就复苏好了。复苏的细胞需要一段时间恢复状态，当复苏后的细胞密度低于80%时，48小时内不要换液，待细胞形态、生长速度等恢复正常，再进行细胞传代等操作。（不要因为复苏后两三天细胞状态不好就丢弃，应耐心等待至少一周。）

当然，细胞复苏后状态很好的情况下，可以提前开始后续的细胞培养实验。