直播答疑 | 三大难养细胞培养解析

6月29日，普诺赛就 RAW 264.7、SF9、NK-92这三个细胞进行了一场直播分享，分别详细讲解了三株细胞的培养方法及需要注意的问题。直播回放可以点击普诺赛公众号菜单栏【资料中心】-【往期直播回放】查看学习。本期直播答疑，从直播间的提问中，筛选出其中有代表性的问题，逐一进行解答。

01

RAW 264.7细胞传代方法：

①　培养基中的漂浮的细胞离心收集

②　轻拍培养瓶，将贴壁松散的细胞拍起来

③　用1ml的枪把贴壁的细胞吹下来

④　将细胞悬液转移到15ml离心管

⑤　1200rpm 离心3min

⑥　去上清，用新鲜培养基重悬细胞

⑦　加入培养皿中（建议用培养皿，方便吹打）

需要观察下细胞的增殖速度，细胞是否是聚团漂浮，如果细胞增殖且聚团漂浮的话，证明细胞活力是可以的。可以尝试将漂浮细胞收集，吹散成单颗，测细胞的数量和活力，培养传代时活细胞密度保持在1-1.5*10⁵/mL，多传几次，细胞就会贴壁展开了。

03

文章中有关RAW264.7细胞在进行M2 型诱导时有的加 IL-4（20 ng/ml）或者 IL4+IL13 诱导、仿生层状壳聚糖支架（LCS），WB/QPCR 检测。主要是看相关指标检测结果（MR(CD206),ArgI 高表达），极化时间需要参考文献，最好是做下预实验，摸索下浓度和时间。

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细胞生长形态以圆形为主，存在梭形状态，此时细胞依旧处于分化程度较低的状态；细胞形态不规则，多触角状态时分化程度较高，贴壁牢固，强行吹打或细胞刮取不当会导致细胞进一步分化，传代时可选择只收集能够轻轻吹打下来的圆形细胞，这部分细胞分化程度最-低，状态最佳，同时更换新的培养容器，可以每天将圆形细胞轻轻吹下来。

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细胞倍增时间是12-30h，本身生长速度快，若是不想频繁传代，可以尝试扩大细胞的传代比例，降低培养基中的血清含量。

06

细胞生长时聚集的细胞团会逐渐增大，正常的细胞团显微镜下为白色透亮的细胞团，若细胞聚团比较多，100倍镜下有6-8个大的细胞团可传代。

传代方法：将培养瓶轻轻晃几下，或者用移液器轻轻吹散（一般吹2-3次即可），吹打力度不可过大，不要全部吹散，否则会出现大量死细胞和细胞碎片。均分到两个瓶子里，每瓶再补充等量培养基；

细胞对营养要求也很高，不能团块过大大导致营养不足。

07

细胞团过大时，镜下观察团中部会发暗，中间的细胞会接触不到营养，可以用枪头轻轻吹1-2下，吹打力度不能太大，将团吹小，不要全部吹散。

08

NK-92细胞平常培养时是会有细胞碎片的，若是有大量碎片，可以一周低速离心一次（800rpm，3min），去除部分死细胞和细胞碎片。

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NK-92细胞培养过程中死细胞和细胞碎片都悬浮在培养基中，培养过程中不会完-全没有死细胞和细胞碎片，且细胞聚团悬浮，平常将细胞吹散成单颗测活力时，也会导致部分细胞损伤，所以活率在80-90%是正常的范围。

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驯化前细胞活率要比较高，能够达到90%以上，驯化过程需要把握好细胞的密度，避免接种密度过低，导致生长速度慢，若是有碎片可以采用800转离心去除。

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可以采用Cellfectin® II 试剂，是一种阳离子脂质制剂，设计用于昆虫细胞的极-佳转染；PEI MAX也可用于转染，转染时可筛选出合适转染培养基，有利于转染效率。

一般会加一个GFP的对照质粒，3-4天后可观察是否有荧光反应，昆虫细胞转染后约5-7天后，大部分细胞变大病变，出现裂解的现象。

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首先要确认下黑点是什么污染，如果是细菌污染，污染物（黑点）较少，细胞形态和生长速度未收到影响时可以尝试5%双抗洗涤2遍，培养基中加大双抗比例，去除污染；如果不是细菌污染，加双抗是没有效果的，需要注意消化时间的把握，传代过程尽量少吹打。

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支原体污染的细胞一般表现为细胞背景脏，背景有大量细胞碎片，细胞生长速度也可能受到影响，具体是否是支原体污染需要进行进一步检测，单凭显微镜观察并不能确定是支原体污染。