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巨噬细胞（Macrophages）是一种位于组织内的白血球，源自单核细胞，单核细胞来源于骨髓中的前体细胞。巨噬细胞在生物体内扮演着多重角色，它们可以吞噬和清除异物和衰老死亡细胞、分泌生物活性物质、调节血细胞生成和参与免疫应答等，是一类在体内发挥重要免疫效应的细胞，并且也是实验室最-常用的细胞种类之一。
骨髓来源巨噬细胞（Bone Marrow Derived Macrophage）是从大鼠或者其他哺乳动物骨髓中的单个核细胞经细胞因子诱导分化得到的一种原代巨噬细胞。本期，我们将以大鼠为例，分享骨髓来源巨噬细胞分离提取和培养注意事项，帮助您顺利上手开展实验。
分离提取步骤
一、分离胫骨和股骨
取2周龄的健康大鼠，断颈法处死；
用超纯水清洗大鼠2次，再用75%酒精浸泡5 min，进行表面除菌处理；
将消毒后的动物转运至超净工作台内；
无菌条件下，用第一套无菌剪刀和镊子剪开腿部皮肤，充分暴露两侧股骨；
更换第二套无菌剪刀和镊子，从大腿根部关节处和脚后跟关节处剪断，分离腿部肌肉，取出胫骨和股骨，将其放在含有PBS的培养皿内。
图1. 分离的胫骨和股骨
二、冲洗骨髓
更换第三套无菌剪刀和镊子，清理胫骨和股骨表面残留的肌肉组织，注意保证骨头完整；
留取纯净骨头，将其转移至新的含有PBS的培养皿内；
取一个新培养皿，加10 mL大鼠骨髓来源巨噬细胞完-全培养基（货号CM-R141）备用；
更换第四套无菌剪刀和镊子，先用镊子固定骨头，再用无菌剪刀剪下骨头两端；
用注射器吸取培养皿内的完-全培养基，从骨头一端插入针头，反复冲洗骨髓至骨头发白透亮，将骨髓液收集在培养皿内；
用5 mL移液枪反复吹打骨髓液，将骨髓液经200目细胞筛过滤，滤液收集于离心管内，离心弃上清，获得骨髓细胞沉淀。
图2. 注射器冲洗骨髓
三、巨噬细胞诱导分化
用含M-CSF（巨噬细胞集落刺激因子）的培养基刺激骨髓单个核细胞分化为巨噬细胞。
M-CSF有两种获取方式：
购买商品化的M-CSF因子（推荐货号：PCK042、PCK043、PCK044、PCK303）。M-CSF的常用浓度范围为10-50 ng/mL，不同品牌的细胞因子使用浓度可能有所差异，需根据实际诱导效果调整使用浓度；
使用培养5-7天的L-929细胞上清[1]。将获得的L-929细胞培养上清高速离心除杂，分装后置于-20℃冷冻保存。通常使用含有20% L-929细胞上清的完-全培养基进行诱导，同时可根据实际诱导效果，调整L-929细胞上清的含量。
图3. 诱导完成的骨髓来源巨噬细胞
细胞培养注意事项
骨髓来源巨噬细胞体外培养不增殖，需注意培养时间，建议尽快进行相关实验；
骨髓来源巨噬细胞难消化，可用利多-卡因消化3 min左右（不建议超过5min），若细胞仍无法消化，更换消化液为0.25%胰蛋白酶，或使用无菌细胞刮。
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