普诺赛细胞学堂 | 细胞转染条件优化“四部曲”，从此告别低效！

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常见的细胞转染方法包括化学法、物理法和病毒载体法^[1]。

化学法包括脂质体转染法、DEAE-葡聚糖法、阳离子聚合物转染法等。其原理是利用转染试剂（如阳离子脂质体、DEAE-葡聚糖、阳离子聚合物等）与带负电荷的核酸形成复合物，并通过内吞作用进入细胞，从而实现细胞转染。化学转染法具有操作简便、适用范围广等优点，但也存在一定的细胞毒性^[2-4]。因此，针对不同的细胞类型，选择适合的转染试剂对转染效果具有决定性影响。

物理法包括显微注射法、电穿孔法等^[5]。其中，电穿孔方法是利用高压电流脉冲在细胞膜上形成瞬时微孔，使核酸等生物分子进入细胞。该方法转染效率高，但对细胞的损伤较大，细胞致死率高。

病毒载体法，如慢病毒、腺病毒和逆转录病毒。尤其是，慢病毒和逆转录病毒可以将基因组整合到宿主细胞中，实现稳定且长期的基因表达^[6]。然而，病毒载体法存在细胞毒性和潜在的生物安全风险，需要严格的操作规范。

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细胞密度是影响转染效率的重要因素之一。

一般来说，贴壁细胞在70%-90%汇合度时转染效果较好。然而，对于某些特殊的细胞系或转染方法，可能需要调整细胞密度。建议在转染前一天设置多个细胞密度梯度进行接种，以便在转染细胞时达到不同的汇合度。转染后，通过实验评估各组的转染效率和细胞状态，以确定最佳的细胞密度范围。

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以脂质体转染为例，脂质体转染试剂和待转物的比例不同，对转染效率和细胞毒性有显著影响。

为了优化转染效果，建议在细胞消化接种到孔板时，每孔加入等量的细胞悬液，以确保转染时细胞密度的一致性。根据转染试剂说明书推荐比例，设置梯度，如转染试剂：待转物比例分别为1:1、2:1、3:1，制备不同浓度的转染复合物，分别加入到相应的孔中，每个比例设置3个重复孔以确保数据的可靠性。将培养板置于细胞培养箱中孵育一定时间后，通过荧光显微镜观察或流式细胞仪检测转染效率，并用CCK-8法检测细胞存活率。根据实验结果，选择转染效率高且细胞毒性低的最佳比例，用于后续实验。

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转染后细胞与转染复合物的孵育时间是影响转染效果的重要因素之一。

孵育时间过短可能导致转染复合物未能充分进入细胞，导致转染效率低；而孵育时间过长则可能增加转染试剂对细胞的毒性，影响细胞状态。为了优化转染效果，建议在转染后设置多个时间点（如6 h、12 h、24 h等）更换培养基，并观察转染效率和细胞毒性变化。对于一些对转染试剂较为敏感的细胞，缩短孵育时间可能有助于降低细胞损伤，同时保持较高的转染效率。通过实验确定最佳孵育时间，以实现转染效果和细胞活性的平衡。在完成一系列优化实验后，需对结果进行系统总结。对比不同条件下转染效率和细胞存活率的数据，分析各参数对转染效果的影响。根据实验结果，总结出适用于特定细胞系或实验体系的转染条件优化策略，为后续实验提供参考依据。

图2. 用EGFP表达质粒转染Hep G2细胞48 小时后的荧光蛋白表达效果（A：白光图，B：荧光图，C：流式检测转染效率）

细胞状态是影响转染效率的关键因素之一。应确保使用处于对数生长期且活力良好的细胞，避免使用传代次数过多或受污染的细胞。

核酸的质量和纯度对转染效果至关重要，应使用无内毒素的高纯度核酸。

在优化转染条件时，建议设置空载体对照、未转染组及阳性对照组，以排除干扰因素，确保实验结果的可靠性。

不同细胞类型对转染方法和条件的要求不同，需根据具体细胞类型和实验目的进行调整。